Описание

Анализ твердых образцов

3. спектрометрия в ближней инфракрасной области(ОФС 42-0099-09)

Спектрометрия в ближней инфракрасной области (БИК спектрометрия, англ. NIR) – метод, основанный на способности веществ поглощать электромагнитное излучение в диапазоне длин волн от 780 до 2500 нм (от 12500 до 4000 см -1 ).

Поглощение в БИК-диапазоне связано, как правило, с обертонами основных колебательных частот связей C-H, N-H, O-H и S-H и их комбинациями. Наиболее информативным диапазоном является область от 1700 до 2500 нм (от 6000 до 4000 см -1 ).

Анализ информации, извлекаемой из БИК-спектров, проводится с применением хемометрических алгоритмов, которые требуют создания первичного массива данных.

В рамках применимости метода, БИК-спектрометрия позволяет прямо или косвенно проводить качественную и количественную оценку химических, физических и физико-химических характеристик анализируемого объекта, в том числе оценивать следующие характеристики:

– содержание воды и органических растворителей;

– гидроксильное и йодное число, степень гидроксилирования;

– кристаллическую форму и степень кристалличности;

– полиморфную форму или псевдополиморфную форму;

– степень дисперсности частиц и другие.

БИК-спектрометрия обладает следующими возможностями:

– простота подготовки проб или отсутствие подготовки;

– неразрушающий характер анализа;

– возможность одновременной оценки нескольких параметров (показателей);

– возможность проведения дистанционного контроля, в том числе в технологических потоках в режиме реального времени.

Приборы. Используют как специализированные БИК-спектрофото­метры, так и другие спектрофотометры, способные работать в ближней
ИК-области спектра.

БИК-спектрофотометры состоят из:

– источника излучения, например, кварцевой лампы (лампы накаливания) или ее аналога;

– монохроматора (дифракционная решетка, призма, оптико-акустический фильтр) или интерферометра (спектрофотометры с Фурье-преобразованием);

– регистрирующего устройства – детектора (на основе кремния, сульфида свинца, арсенида индия, арсенида индия-галлия, теллурида ртути-кадмия, дейтерированного триглицина сульфата и др.);

– устройства размещения образца и/или дистанционного оптоволоконного датчика.

Для размещения образцов используют стеклянные или кварцевые кюветы, флаконы, стеклянные стаканы, держатели капсул или таблеток и другие приспособления.

Спектрофотометры могут быть оснащены кюветным отделением, интегрирующей сферой (интегрирующая сфера представляет собой оптический компонент, состоящий из сферической полости с покрытием из хорошо отражающего материала, сфера предназначена для получения спектров неоднородных образцов), внешними модулями для измерения пропускания сильно рассеивающих образцов, устройствами автоматической подачи образцов, оптоволоконными зондами. Выбор того или иного приспособления для анализа зависит от типа образца и выбранного способа измерения. Поэтому рекомендованы к использованию приборы, реализующие несколько подходов к измерению.

Обработка данных и анализ полученных результатов проводится с использованием специального программного обеспечения.

Для каждого режима измерения (пропускание, диффузное отражение и их комбинация) должна быть предусмотрена своя методика поверки, включающая проверку правильности установки длин волн и поверку фотометрического шума.

Проверка правильности установки длин волн. Для проверки правильности установки длин волн регистрируют спектр стандартного образца, имеющего характеристические максимумы и минимумы поглощения и сравнивают полученные значения длин волн с заявленными характеристиками.

Для режимов пропускания и отражения для определения правильности установки длин волн наиболее распространено в качестве стандартных образцов использовать оксиды редкоземельных элементов, пары воды в атмосфере, метиленхлорид и другие.

В приборах с Фурье-преобразованием шкала волновых чисел линейна во всем рабочем диапазоне и для проверки точности установки достаточно использования одного стандартного образца с контролем заявленных характеристик по одной полосе поглощения. Приборы других типов могут иметь нелинейный характер шкалы волновых чисел и требуют проверки заявленных метрологических характеристик не менее чем по трем пикам (один или несколько стандартных образцов) с охватом всего рабочего диапазона.

Погрешность при установке длин волн должна быть не более ±1 нм (или эквивалентная ему величина волнового числа) в диапазоне длин волн до 1900 нм и не более ±1,5 нм для диапазона длин волн ?1900 нм.

Воспроизводимость установки длины волны должна соответствовать требованиям завода-изготовителя или требованиям нормативных документов, действующих на территории Российской Федерации.

Проверка фотометрической линейности. Для проверки фотометрической линейности регистрируют БИК-спектры стандартных образцов с известными значениями пропускания/отражения и строят графическую зависимость полученных значений пропускания/отражения от известных значений. Результатом построения такой зависимости должна являться прямая линии с пересечением в центре координат (0,00 ± 0,05) и тангенсом угла наклона прямой (1,00 ± 0,05). Для проверки фотометрической линейности в режиме отражения в качестве стандартных образцов используются полимеры, допированные углеродом или аналоги в количестве не менее 4 образцов в диапазоне значений отражения 10–90 %. Для проверки фотометрической линейности в режиме пропускания в качестве стандартных образцов используют фильтры в количестве 3 образцов со значениями пропускания 10–90 % и линию 100 % пропускания (регистрируют спектр пропускания пустого канала).

Проверка фотометрического шума. Для оценки фотометрического шума при измерении пропускания записывают линию 100 % по воздуху; при измерении отражения регистрируют линию 100 % с применением подходящих стандартных образцов с отражающей способностью не менее
99 %. При этом под линией 100 % подразумевается измерение, при котором стандартный образец является измеряемым образцом и фоном одновременно. При высоких значениях поглощения проводят оценку фотометрического шума с применением стандартных образцов со значениями пропускания или отражения около 10 %.

Фотометрический шум должен соответствовать требованиям спецификации производителя.

Способы измерения. БИК-спектр представляет собой зависимость соответствующей фотометрической величины (оптической плотности (А ), пропускания (Т ), коэффициента отражения (R ) и производных величин) от длины волны или частоты излучения. При измерениях в БИК-области реализуются следующие способы:

– измерение поглощения (или пропускания) при прохождении излучения через образец;

– измерение излучения, отраженного или рассеянного от образца;

– комбинация вышеуказанных способов.

Измерения всегда проводят относительно фона.

Измерение пропускания. Пропускание является мерой снижения интенсивности излучения при прохождении через образец. Этот принцип реализован в большинстве используемых спектрофотометров, и результат может быть представлен непосредственно в единицах пропускания (T ) и/или оптической плотности (A ).

В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения.

Способ применим для твердых и жидких проб, в том числе для дисперсных систем.

Специальной подготовки проб при измерении пропускания, как правило, не требуется. Для измерения спектра жидких образцов используют флаконы или кюветы с подходящей длиной оптического пути (обычно 0,5–22 мм), а также оптоволоконные датчики на пропускание.

Диффузное отражение. В методе диффузного отражения измеряют коэффициент отражения (R ), представляющий отношение интенсивности света, отраженного от образца (I ), к интенсивности света, отраженного от фона (I_r ):

или обратную логарифмическую величину этого отношения (А_R ):

В качестве фона используют поверхность с высокой величиной R. пластины из золота, перфторированных насыщенных полимеров, керамические пластины и другие подходящие материалы.

Способ используется для анализа твердых образцов с применением интегрирующей сферы или оптоволоконных датчиков, работающих в режиме отражения. В последнем случае, для воспроизводимости получаемых результатов, необходимо обеспечить стабильность условий проведения измерений, в частности относительную неподвижность датчика, степень нажатия и другие условия.

Способ пропускания-отражения. Данный способ является комбинацией пропускания и отражения благодаря специальной конструкции кювет и датчиков, в которых излучение дважды проходит через образец, что позволяет анализировать образцы с низкой поглощающей и рассеивающей способностью.

В качестве фотометрической величины используют коэффициент двойного пропускания (Т *):

где: I_T – интенсивность излучения после двойного пропускания, без образца;

I – интенсивность пропущенного и отраженного излучения, измеренная с образцом;

и величину, аналогичную оптической плотности (А *):

В качестве фона используют спектр воздуха или среды сравнения.

Способ применим для жидких, в том числе негомогенных проб.

Для регистрации спектра исследуемый образец помещают в кювету с зеркалом или другим диффузным отражателем. Возможно использование оптоволоконного датчика, который погружают в образец.

Факторы, влияющие на результаты измерений

Температура образца. Температура образца может влиять как на его пропускание, так и на его отражение. Контроль температуры важен при анализе термически лабильных объектов, в случае которых разница в несколько градусов может приводить к существенным спектральным изменениям: твердые образцы, содержащие воду, дисперсные системы, аморфные объекты и прочее.

Влага и остаточные количества растворителей. Наличие воды и остаточных количеств растворителей может оказать влияние на характер спектра и результаты анализа. Необходимость и условия высушивания должны быть указаны в частных фармакопейных статьях.

Толщина образца определяет степень пропускания. С увеличением толщины слоя наблюдается увеличение поглощения. Поэтому при сравнительных измерениях пропускания толщина образца должна быть одинаковой или учитываться. При измерении отражения толщина слоя не имеет принципиального значения, но нужно учитывать, что толщина слоя должна быть сопоставимой с глубиной проникновения луча в образец. В случае недостаточной толщины, за образцом ставится дополнительный рефлектирующий материал, например штамп с золотым покрытием.

Оптические свойства образца. При анализе твердых образцов необходимо обеспечивать максимально возможную однородность пробы, так как различия в плотности или размерах частиц сказываются на характере спектра. Спектры физически, химически или оптически гетерогенных образцов следует регистрировать либо с увеличенным размером пучка света, либо используя устройства, вращающие образцы во время измерений. При этом желательно проводить измерения каждого образца несколько раз с последующим усреднением спектров.

Полиморфизм. Разница в кристаллической структуре (полиморфизм) оказывают влияние на спектр, что позволяет отличать друг от друга кристаллические или аморфные формы на основании их БИК-спектра. При проведении анализа необходимо учитывать, эталонный спектр, какой кристаллической структуры (модификации) используется в методе анализа.

Возраст образцов. Свойства образцов могут изменяться во времени, и эти изменения могут обуславливать спектральные различия для одних и тех же образцов. Данные изменения должны быть учтены при построении калибровочных моделей, как для целей идентификации, так и для целей количественного анализа.

Идентификация в БИК-спектрометрии основана на принципе идентичности спектров одного и того же вещества.

Для проведения идентификации первоначально создают библиотеку эталонных спектров (далее по тексту «библиотека»), подбирают оптимальную математическую модель для обработки спектров и реализации алгоритмов их сравнения, то есть создают метод идентификации. Далее проводят валидацию библиотеки в совокупности с выбранной математической моделью (см. раздел «Валидация метода идентификации»). Идентификацию проводят путем сравнения спектра испытуемого образца со спектрами в библиотеке (см. раздел «Анализ данных»).

Создание библиотеки спектров. Библиотека содержит совокупности спектров, несущие характеристическую информацию о каждом объекте анализа. Для каждой совокупности спектров при помощи соответствующих методов и алгоритмов определяют оптимальные параметры идентификации. Данные установки действительны для всей библиотеки. Для близких объектов, неразличимых при заданных установках, создаются подбиблиотеки, в которых могут быть использованы другие методы предварительной обработки спектров и алгоритмы анализа. Количество спектров в библиотеке не ограничивается, но при большом их количестве идентификация химически сходных веществ затрудняется.

В библиотеку включают спектры веществ, соответствующих предъявляемым требованиям, подлинность которых подтверждена иными фармакопейными методами.

Для учета возможных вариаций свойств каждого вида анализируемых объектов регистрируют спектры нескольких партий (серий). Регистрацию спектров проводят при соблюдении схожести условий измерений и первичной обработки, которые предварительно оптимизированы для всех анализируемых объектов и сохраняются постоянными при последующих измерениях. В библиотеку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами.

Методы предварительной обработки спектров. Рекомендуется предварительная обработка спектров с целью повышения информативности получаемых результатов и уменьшения влияния спектральных вариаций. Обработка первичных данных может включать вычисление первой или второй производной, векторную нормализацию, мультипликативную коррекцию рассеивания и другие методы, включая комбинированные. Следует учитывать, что математическая обработка может привести к потере информации или появлению ошибок-артефактов.

Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.

Анализ данных. Сравнение спектров испытуемых образцов при идентификации проводится с индивидуальными или усредненными спектрами в библиотеке, например, путем корреляционного анализа. Метод идентификации должен быть валидирован.

Валидация метода идентификации. Валидация метода идентификации призвана продемонстрировать его пригодность для предусмотренного анализа. Валидация метода предполагает проверку показателей специфичности и устойчивости.

Специфичность показывает, что каждый объект, спектр которого содержится в библиотеке, будет положительно идентифицирован и будет отличаться от других объектов, при этом объекты, не включенные в библиотеку, идентифицируются отрицательно.

Устойчивость показывает, что незначительные изменения условий (например, температура, влажность воздуха, вибрации, температура образца, степень уплотнения материала, глубина погружения зонда, толщина слоя
и т. д.) не влияют на результаты и надежность идентификации.

Разработка методики (калибровка). При разработке методики для количественного анализа (калибровки), изменения интенсивности поглощения или отражения в спектре коррелируются с изменениями свойств и/или состава веществ. При этом регистрируют спектры образцов с известными значениями их химического состава и/или их свойств, подтвержденными иными фармакопейными методами. Так как хемометрические алгоритмы не допускают экстраполяций, необходимо, чтобы область калибровочных концентраций была больше, чем ожидаемый диапазон анализируемых концентраций или свойств. Калибровочные образцы, по возможности, должны быть равномерно распределены внутри диапазона рабочих концентраций.

Регистрацию спектров проводят при соблюдении параметров эксперимента, факторов, влияющих на результаты измерений и первичной обработки, которые предварительно оптимизированы для всех анализируемых объектов и сохраняются постоянными при последующих измерениях. В библиотеку не включают спектры, являющиеся случайными выбросами.

Калибровочную модель оптимизируют при помощи подходящего способа предварительной обработки спектров, выбора спектральной области и математического алгоритма.

Методы предварительной обработки спектров. Проводят так же, как описано в разделе «Идентификация».

Выбор математической модели и алгоритмов должен быть обоснован.

Анализ данных. Для калибровки может использоваться любой обоснованный математический алгоритм. Так как в области ближнего ИК-диапазона наблюдается сильное перекрывание полос поглощения, количественный анализ проводят с реализацией преимущественно хемометрических алгоритмов, например таких, как метод частных наименьших квадратов (МЧНК, англ.PLS), метода регрессии на главные компоненты (МРГК, англ.PCR) и других.

Валидация калибровочной модели. Валидация модели калибровки предполагает демонстрацию ее пригодности для решения поставленной задачи. При этом должны быть оценены такие показатели, как специфичность (селективность), линейность, рабочий диапазон концентраций (аналитическая область), правильность, прецизионность и устойчивость.

Для демонстрации специфичности существуют следующие подходы:

– выбранный спектральный диапазон или полоса поглощения связана с анализируемым свойством объекта (например, концентрация, содержание влаги и т. д.) и коррелирует с фотометрической величиной;

– демонстрируется, что изменения в составе плацебо в пределах рабочего диапазона концентраций не оказывают существенного влияния на результаты количественного измерения определяемого образца;

– допускаются другие обоснованные подходы.

При валидации линейности должно быть показано, что результаты, полученные методом БИК с реализацией выбранного алгоритма обработки, сопоставимы с результатами, полученными другим стандартным методом. В качестве критерия приемлемости может быть выбран коэффициент детерминации (r 2 ), коэффициент корреляции (r ) или иной критерий, определяющий пригодность калибровочного метода.

Диапазон рабочих концентраций определяет интервал, в котором соблюдаются заявленные валидационные показатели. Результаты испытаний, выходящие за пределы данного диапазона, являются неприемлемыми.

Правильность методики должна доказывать отсутствие значимой систематической погрешности или обоснованность поправочных коэффициентов, вводимых в расчеты при ее наличии. Правильность оценивается путем сопоставления результатов, полученных с использованием модели калибровки и результатов, полученных стандартным методом.

Прецизионность описывает степень рассеивания результатов анализа. При этом должна быть оценена как внутрилабораторная, так и межлабораторная прецизионность.

Устойчивость методики количественного анализа показывает, что незначительные изменения условий не влияют на результаты количественного определения.

Выбросы. При анализе методом БИК следует учитывать, корректировать или обоснованно исключать резко выделяющиеся результаты как внутри рабочего диапазона, так и вне данного диапазона.

Выбросы, находящиеся в пределах рабочего диапазона, подлежат дальнейшему исследованию и, в случае их информативной важности, могут быть включены в модель.

Выбросы, находящиеся вне калибровочного диапазона, также подлежат анализу. Если полученные результаты подтверждены стандартным методом, спектры таких проб могут быть внесены в калибровочную модель с последующей ревалидацией метода.

Ревалидация. Прошедший валидацию и признанный пригодным для применения БИК-метод идентификации или количественного анализа нуждается в последующей периодической валидации (ревалидации). При установлении отклонений необходима корректировка метода. Необходимость ревалидации зависит от характера изменений.

БИК-метод нуждается в ревалидации, если:

– в библиотеку добавляется новый объект (для качественного анализа);

– есть предпосылки к изменению характеристик объектов, спектры которых уже включены в библиотеку (изменение технологии производства (синтеза), состава, качества исходного сырья упаковки и т. д.);

– обнаружены иные изменения и/или несоответствия в свойствах анализируемых объектов или методике.

Перенос методик. При переносе методик идентификации и количественного анализа с одного прибора на другой должны учитываться спектральные характеристики используемых спектрофотометров (разрешение, диапазон волновых чисел и др.). Спектрофотометры с высокой фотометрической точностью и точностью по волновому числу (например, Фурье-спектрофотометры), позволяют осуществить прямой перенос методов как качественного, так и количественного анализа без дополнительных манипуляций. Если прямой перенос невозможен, применимы различные математические способы для переноса моделей.

После перенесения методов необходима их ревалидация.

Хранение данных. Хранение данных осуществляется в электронном виде в соответствии с требованиями программного обеспечения. При этом необходимо сохранять исходные спектры, не подвергшиеся математической обработке, с целью их возможного дальнейшего использования при оптимизации библиотек или методов.