Способ получения кормогризина

Использование: микробиологическая промышленность, в частности, производство кормового антибиотика кормогризина. Сущность способа заключается в том, что осуществляютб культивирование продуцента гризина Actinomyces grlseus, подкисление культуральной жидкости до рН 5-5,5, концентрированна вакум-выпэркой, распылительную сушку и стандартизацию целевого продукта, при этом культуральную жидкость после подкисления разделяют путем центрифугирования на мицелиальную часть и фугат до содержания в мицелиальной части 10-20% сухих веществ, концентрированию подвергают фугат до вязкости 0,8-1,2 сСт с последующим возвратом концентрата на стадию разделения, а распылительной сушке подвергают мицелиальную часть. Центрифугирование осуществляют при факторе разделения Кр 2800-3400. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 Р 1/06

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ жида """"

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4679030/13 (22) 17.03.89 (46) 30.05.93. Бюл, hL 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производств (72) Ю.P.Iineaae?, В.Е.Морозов, В.Г,Романенко и Ю,Д.Колыганов (56) Промышленный регламент на производства кормогризина, 1974, с. 62-72, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОГРИЗИНА (57) Использование: микробиологическая промышленность, в частности, производство кормового антибиотика кормогризина.

Сущность способа заключается в том, что

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве кормового антибиотика кормогризина, Целью изобретения является повышение выхода конечного продукта за счет предотвращения снижения его активности от тепловой инактивации, Это достигается тем, что в способе получения кормогризина, включающем культивирование продуцента антибиотика гризина Actinomyces griseus, доведение культуральной жидкости до рН 5-5,5, концентрирование путем вакуум-выпарки, распылительную сушку и стандартизацию конечного продукта, отличием является то, что после подкисления культуральную жидкость разделяют путем центрифугирования на мицелиальную часть и фугат до содержа. БЫ„„1818346 А1 осуществляютб культивирование продуцента гриэина Actinomyces griseus, подкисление культуральной жидкости до рН 5 — 5,5, концентрирование вакум-выпаркой, распылительную сушку и стандартизацию целевого продукта, при этом культуральную жидкость после подкисления разделяют путем центрифугирования на мицелиальную часть и фугат до содержания в мицелиальной части 10 — 207ь сухих веществ, концентрированию подвергают фугат до вязкости

0,8-1,2 сСт с последующим возвратом концентрата на стадию разделения, а распылительной сушке подвергают мицелиальную часть. Центрифугирование осуществляют при факторе разделения Kp = 2800-3400.

1 з.п. ф-лы, 4 ил, ния в мицелиальной части 10-200 сухих веществ, после чего мицелиальную часть подвергают распылительной сушке и стандартизации, а фугат подвергают концентрированию до вязкости v = 0,8 — 1,2 сСт путем вакуум-выпарки и возвращают на центрифугирование, Изобретение осуществляют следующим образом.

Схема получения кормогризина представлена на фиг.1. Процесс культивирования проводят в течение 48-72 ч при температуре в аппарате 27+.1 С и непрерывном перемешивании содержимого аппарата при помощи воздуха, проходящего через турбину аэратора, Давление в аппарате 0,15-0,5 кгс/см, После окончания про2 цесса культивирования культуральную жидкость подкисляют до рН 5 — 5,5. Как показали проведенные авторами эксперимен1818346 тальные исследования, именно при таких значениях водородного показателя большая часть антибиотика гриэина при его цен,трифугировании сосредотачивается в мицелиальной части (фиг.2). После подкисления культуральную жидкость разделяют на центрифуге на фугат и мицелиальную часть. Центрифугирование осуществляют при факторе разделения Kp = 2800 — 3400, который обеспечивает содержание сухих 10 веществ в мицелиальной части в пределах

10 — 20 (фиг.З). Такое количество сухих веществ в мицелиальной части перед распылительной сушкой обусловлено следующим: содержание менее 10 сухих веществ делает процесс распылительной сушки экономически не выгодным, а содержание более 20ф, сухих веществ нарушает режим распылительной сушки, что ведет к значительным потерям целевого продукта, Далее, 20 мицелиальную часть с содержанием 10 — 20 (, сухих веществ подвергают распылительной сушке с последующей стандартизацией, а фугат подвергают концентрированию на вакуум-выпарной установке до вязкости 25 и = 0,8 — 1,8 сСт и возвращают на центрифу-. гирование.

Значения вязкости обусловлены следующим.

Как видно иэ представленной зависимо- 30 сти (фиг.4), полученной экспериментальным путем при выпаривании культуральной жидкости кормогриэина на вакуум-выпарной установке "Вигонд", основные потери продукта по активности наблюдаются после 35 достижения вязкости культуральной жидкости кормогриэина примерно 1,2 сСт. Это происходит из-за того, что в процессе выпаривания вязкость культуральной жидкости непрерывно растет, что приводит к ухудше- 40 нию условий выпарки, к налипанию продукта на стенки выпарного аппарата, к его пригоранию и инактивации в результате длительной тепловой обработки.

Проведение же процесса выпаривания 45 ниже значения вязкости м= 0,8 сСт экономически нецелесообразно, Изобретение позволяет снизить потери конечного продукта на стадии выпарки более чем в 3 раза (с 15 при существующей 50 технологии до 4,7ф,), Пример 1. Культуральную жидкость кормогризина после ферментации объемом .120 м с содержанием сухих веществ 4,9 u з активностью A> - 91,2.10 ед. ;доводят 55 до рН 5 и затем подают на центрифугирование, где разделяют в поле действия центробежных сил с фактором разделения

Kp - 2800 на фугат и мицелиальную часть, Далее мицелиальную часть с содержанием сухих веществ 10,5 подают на распылительную сушилку, а фугат с вязкостью

0,2 сСт направляют на вакуум-выпарку, где концентрируют до вязкости 0,8 сСт, и возвращают на разделение. Активность сухого

-ю вещества после распылительной сушки А =

=90,37.10 ед„т.е, потери по активности составляют 17.

Потери по активности по прототипу в аналогичных условиях составляют 18%, Пример 2. Культуральную жидкость кормогризина после ферментации объемом

130 м с содержанием сухих веществ 4,7 u з активновностью А1 = 93,8 10 o ед, доводят до рН = 5,2 и затем подают на центрифугирование, где разделяют в поле действия центробежных сил с фактором разделения

Kp = 3100 на фугат и мицелиальную часть.

Далее мицелиальную часть с содержанием сухих вещств 14 подают на распылительную сушку, а фугат с вязкостью О, t5 сСт направляют на вакуум-выпарку, где концентрируют до вязкости 1 сСт и возвращают на разделение, Активность сухих веществ после распылительной сушки Az =

=91,5 10 ед. т.е. потери по активности составля ют 2,5.

Потери по активности по прототипу в аналогичных условиях составляют t4, Пример 3. Культуральную жидкость кормогризина после ферментации объемом 130 м с содержанием сухих веществ з

4,6 и активностью А1 = 95,8.10 ед.-до-, водят до рН = 5,5 и затем подают на центрифугирование, где разделяют в поле действия центробежных сил с фактором разделения Kp = 3400 на фугат и мицелиальную часть. Далее мицелиальную часть с содержанием сухих веществ 20 подают на распылительную сушку, а фугат с вязкостью

0,1 сСт направляют на вакуум-выпарку, где концентрируют до вязкости 1,2 сСт и возвращают на разделение, Активность сухого вещества после распылительной сушки А =

92,4 10 ед. т.е, потери по активности составляют 3,67. Потери по активности по прототипу в аналогичных условиях составляют 16, Формула изобретения

1. Способ получения кормогризина, включающий культивирование продуцента гризина Actinomyces grlseus, подкисление культуральной жидкости до рН 5,0-5,5, концентрирование вакуум-выпаркой, распылительную сушку и стандартизацию целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, культуральную жидкость после подкис1818346 деления, а распылительной сушке подвергают мицелиальную часть.

Составитель Ю, Москевич

Редактор О. Павлова Техред М.Моргентал Корректор П. Гереши

Заказ 1926 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101 ления разделяют путем центрифугирования на мицелиальную часть и фугат до содержания в мицелиальной части 10-20 сухих веществ, концентрированию подвергают фугат до вязкости 0,8 — 1,2 сСт с последующим возвратом концентрата на стадию раэ2. Способ no ri 1, отличающийся

5 тем, что центрифугирование осуществляют при факторе разделения Кр - 2800 — 3400.

ГОСТ 27786-88: Кормогризин

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Официально распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль".

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

Распространяется на кормогризин - препарат, состоящий из антибиотика гризина, получаемый путем микробиологического синтеза с использованием культуры Act. Griseus и наполнителей и предназначенный для использования при выращивании и откорме сельскохозяйственных животных.

Заменен на ГОСТ 28495-90. Правила приемки и методы отбора проб в части разд. 2 (ИУС 6-90)

Ограничение срока действия снято: Протокол № 3-93 МГС от 12.03.93 (ИУС 5-93)

Действие завершено 01.01.1991

Fodder Griseus. Specifications

Срок действия с 01.01.89 до 01.01.94

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на кормогризин — препарат, состоящий из антибиотика гризина, получаемый путем микробиологического синтеза с использованием культуры Act. griseus и наполнителей и предназначенный для использования при выращивании и откорме сельскохозяйственных животных.

1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

1.1. Кормогризин должен изготовляться в соответствии с требованиями настоящего стандарта по технологическому регламенту, утвержденному в установленном порядке.

1.2.1. Кормогризин изготовляют с наполнителем. В качестве наполнителя используют кукурузную или пшеничную муку, пшеничные или ржаные отруби.

Наполнитель по крупности и влажности должен соответствовать значениям, установленным для кормогризина.

1.2.2. В зависимости от содержания активного действующего начала — антибиотика гризина — кормогризин изготовляют двух марок: кормогризин-10 и кормогризин-40.

1.2.3. По физико-биологическим показателям кормогризин должен соответствовать требованиям, указанным в таблице.

© Издательство стандартов, 1988

Появление нингидриноокрашенных компонентов на хроматограмме, совпадающих по положению с нингидрино-окрашенными компонентами стандартного образца гризина, а также зон задержки тест-культуры от испытуемых компонентов пробы

Не допускается 15

1.3. Требования безопасности

1.3.1. Препарат кормогризина изготовляют в соответствии с правилами безопасности для производства микробиологической промышленности, утвержденными Госгортехнадзором СССР.

1.3.2. Предельно допускаемая концентрация препарата в воздухе рабочих помещений не должна превышать 0,4 мг/м 3 .

1.3.3. При работе с препаратом необходимо применять индивидуальные средства защиты: рес.пиратор, защитные очки, резиновые перчатки, также соблюдать меры личной гигиены.

1.3.4. Производственное оборудование должно отвечать требованиям ГОСТ 12.2.003-74 .

1.3.5. Для предупреждения опасного и вредного воздействия микроорганизмов следует соблюдать требования биологической безопасности по ГОСТ 12.1.008-76 .

1.3.6. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны — по ГОСТ 12.1.005-76 .

1.4.1. На каждый бумажный мешок наносят транспортную маркировку по ГОСТ 14192-77 с изображением манипуляционных знаков «Боится сырости», «Боится нагрева», «Крюками непосредственно не брать» и с указанием дополнительных сведений:

1) наименования ведомства;

2) наименования предприятия-изготовителя и (или) его товарного знака;

3) наименования и марки препарата;

5) номера партии;

6) даты изготовления препарата;

7) гарантийного срока хранения;

8) условий хранения;

9) предупредительных надписей «Хранить с предосторожностью. Список Б». «Для ветеринарии»;

10) обозначения настоящего стандарта.

1.4.2. В каждый бумажный мешок вкладывают инструкцию по применению препарата в количестве, равном числу полиэтиленовых мешков.

1.5.1. Кормогризин фасуют по 5, 10 и 20 кг в мешки из полиэтиленовой пленки по ГОСТ 10354-82 или мешки полиэтиленовые по ГОСТ 17811-78. Полиэтиленовые мешки термоспаивают и упаковывают в бумажные четырехслойные мешки по ГОСТ 2226—75.

Допускается фасовать кормогризин в бумажные мешки марок БМ, ВМ, ПМ, БМП, ВМБ, ВМП по ГОСТ 2226-75 .

1.5.2. Бумажные мешки зашивают машинным способом нитками по ГОСТ 14961-85. или по ГОСТ 6309-87. или шпагатом по ГОСТ 17308-85. оставляя гребень по всей ширине мешка не менее 4 см.

Допускается вместо зашивания бумажных мешков их склеивание по ГОСТ 18251-87 .

1.5.3. Масса нетто упаковочной единицы должна составлять. (20 ±0,2) кг.

2.1. Кормогризин принимают партиями. Партией считают любое количество препарата, изготовленное за один технологический цикл, однородное по показателям качества и оформленное одним документом о качестве.

В документе о качестве указывают:

1) наименование организации, в систему которой входит предприятие-изготовитель;

2) наименование предприятия-изготовителя и (или) его товарный знак;

3) наименование и марку препарата;

5) массу нетто партии;

6) количество мест в партии;

7) дату изготовления препарата (год, месяц, число);

8) результаты испытаний; дату выдачи документа о качестве;

9) гарантийный срок и условия хранения;

10) обозначение настоящего стандарта.

2.2. Для проверки качества кормогризина от каждой партии отбирают выборку в размере: от партии до 100 упаковочных единиц— не менее 5 упаковочных единиц; свыше 100 упаковочных единиц —5%.

2.3. Подлинность кормогризина определяют в каждой 10-й партии. При изменении технологии изготовления кормогризина, подлинность определяют в пяти партиях подряд.

2.4. При неудовлетворительных результатах испытаний хотя бы по одному показателю по нему проводят повторные испытания на удвоенном количестве выборки, взятой от той же партии продукции.

Результаты испытаний распространяют на всю партию.

3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ

3.1.1. От каждой упаковочной единицы отбирают 2—3 точечные пробы щупом вместимостью не более 50 г, погружая его на всю глубину мешка.

3.1.2. Точечные пробы объединяют, тщательно перемешивают и выделяют среднюю пробу массой не менее 600 г.

3.1.3. Среднюю пробу делят пополам и помещают в две чистые сухие банки с притертыми пробками или в полиэтиленовые мешочки.

Одну банку или мешочек передают в лабораторию для анализа качества препарата, а другую банку или мешочек хранят в течение срока годности препарата на случай разногласий в оценке качества.

3.1.4. Пробы, направляемые в лабораторию или на хранение, опечатывают и снабжают этикеткой с указанием:

1) наименования предприятия-изготовителя и (или) его товарного знака;

2) наименования препарата;

3) номера партии;

4) массы нетто партии;

5) даты отбора пробы;

6) должности и подписи лица, отбиравшего пробу;

7) гарантийного срока хранения.

3.2. Определение внешнего вида и плесени

Навеску массой 50 г рассыпают на белую чистую поверхность,

рассматривают и определяют цвет и наличие плесени при естественном освещении.

3.3. Определение массовой доли влаги

Сущность метода заключается в высушивании препарата при

нагревании до постоянной массы при температуре (105±2)°С и определении влаги по разности результатов взвешиваний.

3.3.1. Аппаратура и реактивы

Сушильный шкаф любого типа, обеспечивающий температуру нагрева от 100 до 200°С с точностью терморегуляции ±2°С.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 1-го и 2-го классов точности с пределом взвешивания 200 г.

Бюксы, изготовленные из некоррозируемого металла, или стаканчики СВ 14/8; 19/9; 24/10; 34—2 по ГОСТ 25336-82 .

Эксикатор исполнения 2 с диаметром корпуса 100, 140, 190, 250 мм по ГОСТ 25336-82. содержащий силикагель с добавлением индикатора влажности или прокаленный хлорид кальция.

3.3.2. Проведение испытания

Открытую бюксу и крышку помещают в сушильный шкаф при температуре (105±2)°С на 30 мин. Затем закрывают бюксу крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Высушивание бюксы с крышкой проводят до достижения постоянной массы.

5 г препарата помещают в бюксу. Открытую бюксу и крышку помещают в сушильный шкаф при температуре (105±2)°С на 4 ч, затем закрывают бюксу крышкой, переносят в эксикатор, охлаждают до комнатной температуры и быстро взвешивают.

Вновь высушивают образец в течение 1 ч, охлаждают и взвешивают. Повторяют высушивание до тех пор, пока разность результатов двух последовательных взвешиваний будет не более 0,0004 г. Если после повторного высушивания масса увеличится, за результат принимают наименьшее значение.

3.3.3. Обработка результатов

Массовую долю влаги (Xi) в процентах вычисляют по формуле

где т 1 — масса бюксы с пробой до высушивания, г; т₂ — масса бюксы с пробой после высушивания, г; т₃ — масса бюксы, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения не должны отличаться от среднего значения более чем на 5% (отн.).

3.4. О п р е д е л е н и е крупности помола

Сущность метода заключается в гравиметрическом определении остатка на сите после просеивания пробы.

Установка для рассева с ситами: с номинальными размерами ячейки 0,560 мм и 1,00 мм по ГОСТ 4601-73 .

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 1-го и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

3.4.2. Проведение испытаний

100 г препарата помещают на сито, которое закрывают крышкой, укрепляют на платформе установки для рассева, включают установку и просеивают в течение 10 мин при 190—210 колебаниях в минуту.

Допускается просеивание ручным способом при ПО—120 колебаниях в минуту и размахе колебаний около 10 см.

3.4.3. Обработка результатов

Остаток на сите (Х₂ ) в процентах вычисляют по формуле *2=—^-100,

где т₄ — масса остатка на сите, г;

т₅ — масса пробы, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения не должны отличаться от среднего значения более чем на 10% отн.

3.5. Определение гризина

Сущность метода заключается в сравнении зон задержки роста тест-культуры Вас. subtilis 6633 испытуемым препаратом и стандартом гризина. Чувствительность метода 0,5 ЕД в 1 мг.

3.5.1. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды

pH-метр с погрешностью измерения не более 0,1.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-80 1-го и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

Автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75 .

Термостат любого типа, обеспечивающий температуру нагрева (37 ± 1) а С.

Столик с горизонтальной пластиной вертикального стекла.

Сушильный шкаф любого типа, обеспечивающий температуру нагрева от 100 до 200°С с погрешностью терморегуляции ±2°С.

Термометр с ценой деления PC и диапазоном измерения от О до 100°С.

Баня водяная любого типа, обеспечивающая температуру нагрева от 20 до 100°С с погрешностью терморегуляции ±3°С.

Бур или пробочное сверло с внутренним диапазоном 8 мм.

Капельницу, представляющую собой инъекционную иглу, впаянную в стеклянную трубку диаметром 5—7 мм, на конец которой одета резиновая груша.

Колбы мерные вместимостью 100, 1000 см 3 по ГОСТ 1770-74 .

Колбы конические вместимостью 100 см 3 по ГОСТ 25336-82 .

Чашки бактериологические (чашки Петри) типа ЦБН исполнения 2, номинальным диаметром 100 мм по ГОСТ 25336-82 .

Пипетки вместимостью 5, 10 и 20 см 3 исполнения 6, 7 по ГОСТ 20292-74 .

Пробирки типа Ш диаметром 16 мм, высотой 150 мм из химически стойкого стекла группы ХС по ГОСТ 25336-82 .

Спиртовки стеклянные по ГОСТ 25336-82 .

Воронка типа В диаметром 100 мм высотой 150 мм по ГОСТ 25336-82 .

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76 .

Образец стандартный стеклянный для визуального определения мутности бактериальных взвесей, мутность которого равна 1,66 см -1 и эквивалента 10 международным единицам мутности.

Цилиндры мерные вместимостью 50 см 3 по ГОСТ 1770-74 .

Гризина сульфат стандартный с активностью, указанной на этикетке.

Тест-микроорганизм Вас. subtilis 6633.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280-76 .

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77. растворы концентрации 0,01 моль/дм 3 (0,01 н.) и 0,2 моль/дм 3 (0,2 н.).

Кальций фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75 .

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805-76 .

Агар микробиологический по ГОСТ 17206-84 или агар пищевой по ГОСТ 16280-70 .

Раствор буферный лимоннокислый с pH 3—3,2; готовят смешением двух растворов: 62 см 3 раствора А и 100 см 3 раствора Б.

Растворы А и Б готовят следующим образом:

раствор А — 22,6 г цитрата дигидрата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 и доливают воду до метки;

раствор Б—8,2 см 3 концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 и разбавляют водой до метки.

Растворы для окраски по Граму.

Бульон мясо-пептонный (МПБ) по ГОСТ 20730-75 .

Среда агаровая голодная; готовят следующим образом:

15 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, помещают в колбу вместимостью 1000 см 3. содержащую 900 см 3 воды. Колбу ставят на водяную баню и нагревают до полного расплавления агара. 3 г дигидроортофосфата калия, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 100 см 3 воды, затем выливают в расплавленный агар, доводят объем водой до 1000 см 3 и перемешивают. Устанавливают pH 8,0 при помощи 30%-ного раствора гидрооксида натрия. Агаровую среду кипятят до образования осадка, затем фильтруют через толстый слой ваты и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре (110±1)°С. pH среды поля стерилизации должна быть 7,8—8,0. Среду хранят при температуре 20—22°С не более двух месяцев.

Среда агаровая питательная; готовят аналогично приготовлению агаровой голодной среды, при этом взамен воды берут МПБ с содержанием аминного азота 50—60 мг в 100 см 3 бульона. Питательную среду стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре (110±1)°С. После стерилизации pH раствора должна быть 7,8—8,0. Раствор хранят в течение месяца при комнатной температуре.

Агар мясо-пептонный (МПА)—среда для культуры Вас. subtilis 6633; готовят следующим образом: МПБ разбавляют водой в соотношении 1:2. К 1000 см 3 разбавленного МПБ добавляют 20 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г. Для набухания агара смесь выдерживают в течение 40—60 мин при комнатной температуре.

МПА расплавляют на водяной бане, устанавливают pH 7,2—7,4 при помощи 30%-ного раствора гидрооксида натрия, дают среде отстояться в течение 30 мин, после чего среду фильтруют через толстый слой ваты, затем разливают в колбы и стерилизуют при температуре (110±1)°С в течение 30 мин. pH среды после стерилизации должен быть 7,2—7,4.

Среда для выращивания спор Вас. subtilis 6633 в матрицах; готовят следующим образом: 25 г агара, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, добавляют на 1000 см 3 бульона Хоттингера с содержанием 30—35% аминного азота. Полученную среду разливают по матрицам и стерилизуют в течение 30 мин при температуре (110±1)°С. pH после стерилизации должен быть 6.0—6,2.

Суспензия тест-культуры Вас. subtilis 6633 готовят следующим образом: тест-культуру Вас. subtilis 6633 переносят микробиологической петлей в пробирку с физиологическим раствором, затем пипеткой каплю полученной суспензии переносят в чашки Петри со средой МПА, растирают ее по чашке стеклянным шпателем, после чего этим же шпателем переносят оставшуюся на нем культуру из чашки в чашку с вышеуказанной средой путем растирания (5—7 чашек), добиваясь таким образом в последующем роста отдельных характерных колоний.

Тест-культуру выращивают при температуре 37°С в течение 18—24 ч. Затем отбирают типичные колонии — мелкие, сероватые с зубчатым краем и пересевают бактериальной петлей на скошенный МПА в пробирку и выращивают при температуре 37°С в течение 18 ч, после чего культуру со скошенного агара смывают 5—10 см 3 стерильной дистиллированной воды и смыв переносят в матрацы. Засеянный матрац выдерживают при температуре 37°С в течение 5—7 сут, после чего производят микроскопический контроль и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80—90% спор, делают смыв культуры стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при температуре 60—70 С С на водяной бане в течение 30 мин, затем взвесь спор промывают не менее трех раз стерильной дистиллированной водой при центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор хранят в стерильной дистиллированной воде в запаянных ампулах или пробирках в течение двух лет при температуре от 4 до 10°С.

Гризина основной стандартный раствор концентрации 1000 ЕД в 1 см 3 ; раствор готовят следующим образом: 20 мг стандартного образца гризина, взвешенные с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в рассчитанном объеме раствора соляной кислоты концентрации 0,01 моль/дм 3 .

Объем раствора соляной кислоты (А₃ ) в кубических сантиметрах вычисляют по формуле

где те — масса стандартного образца сульфата гризина, мг;

А — активность стандартного образца сульфата гризина, ЕД в 1 мг (весовое выражение 1 ЕД активности сульфата гризина зависит от активности действующего в настоящее время стандартного образца);

1000— активность основного стандартного раствора сульфата гризина, ЕД в 1 см 3 .